細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒  Cell Counting Kit-8(CCK-8/CCK8)

產(chǎn)品簡介:

Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8 試劑盒，為MTT 法的替代方法，是一種基于WST(水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽) ，是用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

水溶性四唑（2-（2-甲氧基-4硝基ben）-3-(4-硝基ben)-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽），是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料(formazan,下圖)， 這種甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。水溶性四唑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠。細(xì)胞增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。正是利用這一特性開發(fā)的CCK-8試劑盒直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析。CCK-8法應(yīng)用非常廣泛，可以用于生物活性因子的活性檢測，抗腫瘤藥物的篩選，細(xì)胞增值的測定，細(xì)胞毒性檢測以及藥敏等與細(xì)胞活性和增殖相關(guān)的實驗。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經(jīng)配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即開即用，無需其他準(zhǔn)備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶標(biāo)儀上檢測，適合大規(guī)模高通量的樣品檢測。

CCK-8法與MTT比較：

CCK8試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全，重現(xiàn)性好的細(xì)胞增殖與活性檢測方法。與傳統(tǒng)的MTT相比無需有機溶劑和放射性同位素，步驟少，無損失，結(jié)果準(zhǔn)確！本試劑盒檢測非常便捷。試劑盒僅一管已經(jīng)配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作 。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細(xì)胞，不必收集細(xì)胞，也不必采用額外的步驟去溶解formazan。可以用于大批量樣品的檢測。

1.MTT實驗生成的甲臜不是水溶性的，需要使用DMSO等有機溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，不僅省去了溶解的步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

2.與MTT方法相比，本方法線性范圍更寬，靈敏度更高。本方法對細(xì)胞無毒性，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)多次測定從而找到較佳測定時間。

3.本方法所用試劑在培養(yǎng)基中比MTT更加穩(wěn)定，實驗效果重復(fù)性好。

4.MTT具有毒性，同時其生成的甲臜需要有機溶劑溶解，會對操作人員身體造成危害。本試劑無毒，使用中無需有機溶劑，操作更加安全。

5.本試劑盒在4℃避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。

6.酚紅和血清對CCK法的檢測不會造成干擾（扣除空白孔即可）

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常見問題與解答:

Q1.設(shè)定參比波長的目的是什么？必須要設(shè)定嗎？        

A1.不一定要設(shè)定。 CCK-8試劑在參比波長處沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。

Q2.如何設(shè)定空白對照？

A2.在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗 (細(xì)胞毒性實驗) 時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中測定450 nm的吸光度作為空白對照。

Q3.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

A3.有時會有影響。如果藥物具有氧化還原性，會和CCK-8發(fā)生反應(yīng)，吸光度發(fā)生變化。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度，如果它的吸光度與不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK-8）的吸光度相比有明顯變化，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q4.不更換培養(yǎng)基加CCK-8試劑，有沒有問題？

A4.一般沒有問題。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質(zhì)的話，可能會產(chǎn)生誤差，必須更換其他培養(yǎng)基。我以下培養(yǎng)基會影響測定：培養(yǎng)基IMDM的空白吸收1.0；培養(yǎng)基McCoy/s的空白吸收0.3。

Q5.哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？

A5.當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK-8的測定，增加O.D.值；在有氧化性物質(zhì)存在時會抑制測定反應(yīng)的發(fā)生，減小O.D.值；在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可；血清不影響測定。

Q6.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑？

A6.一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10.

Q7如何減少由于CCK-8試劑在槍頭或者孔壁上的殘留所帶來的誤差 ？

A7.可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

Q8.每次測定的O.D值不一樣，是什么原因？如何解決？

A8.可能會有以下幾個原因：

1.當(dāng)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，培養(yǎng)板較外一圈的孔較容易干燥揮發(fā)，導(dǎo)致培養(yǎng)基的體積不一樣，從而增加誤差。一般情況下，較外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

2.有可能會因為CCK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3.每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請預(yù)先在1000-100000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。

Q9.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)？ A9. 有以下幾種方法：注意: 反應(yīng)停止后, 應(yīng)在24小時內(nèi)測定。

1)每孔加10ul0.1M HCI溶液。2)在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放入4℃冰箱內(nèi)。3)每孔加10ul 1%(w/v)的SDS（十二烷基磺酸鈉）溶液。

Q10.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？

A10.縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。

Q11.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？

A11.不一定。如果要想保持細(xì)胞的較好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有研究人員不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。

Q12.如果加入的藥物中有金屬，是否會有影響？

A12.金屬對CCK-8顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、Fecl3、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。

Q13.CCK-8的保質(zhì)期有多久？

A13.CCK-8在避光0-5℃的條件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要長期保存，我們推薦在-20℃儲藏。正常的CCK-8顏色為淺粉色，如有明顯顏色變化，則CCK-8的質(zhì)量有可能發(fā)生變化。CCK-8若反復(fù)凍融有可能會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若短時間頻繁使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。

Q14.預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計數(shù)嗎？

A14.一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細(xì)胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精確計數(shù)細(xì)胞，可以預(yù)培養(yǎng)后去培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。

Q15.CCK-8是否對細(xì)胞進行染色？

A15.CCK-8不對細(xì)胞進行染色。培養(yǎng)基中的CCK-8并不進入細(xì)胞內(nèi)染色細(xì)胞，而是在電子載體的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲臜染料，是一個顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)后，更換新的培養(yǎng)基，可以繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

Q16.CCK-8對于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

A16.不同細(xì)胞的脫氫酶活性不一樣，顯色程度不一樣，靈敏度也不一樣。

Q17.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在接種數(shù)量上有何區(qū)別？

A17.大部分懸浮細(xì)胞相比貼壁細(xì)胞比較難顯色，O.D.值偏低，一般需要增加細(xì)胞接種數(shù)量或延長加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。貼壁細(xì)胞顯色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。

Q18.應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

A18.建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Q19.有時在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細(xì)胞數(shù)量？

A19.不能。由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則實際測定的活細(xì)胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。

Q20.CCK-8是什么顏色？  

A20.應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

Q21.導(dǎo)入基因后，是否用CCK-8來檢測活細(xì)胞？    

A21.可以

Q22.在pH5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，是否可以用CCK-8試劑檢測？

A22.理論上可以的，但是需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線進一步確定。

Q23.O.D.值在什么范圍比較合適？

A23.一般情況下O.D.值在0.1-2.0范圍內(nèi)都可以，在1.0附近較好。

Q24.細(xì)菌是否會和CCK-8試劑發(fā)生反應(yīng)？

A24.CCK-8不會和細(xì)菌發(fā)生顯色反應(yīng)。細(xì)菌防御系統(tǒng)強，不會發(fā)生還原反應(yīng)

Q25.CCK-8試劑用于測定活細(xì)胞的數(shù)量，對于增殖期的細(xì)胞和靜止期的細(xì)胞，有何影響？A25.一般情況下CCK-8試劑用于檢測對數(shù)生長期的細(xì)胞。如果靜止期細(xì)胞的脫氫酶活性和增殖期的細(xì)胞的脫氫酶活性有很大的 不同的話，則兩者會有很大的差別。

Q26.如果O.D.值太低，可以采取什么辦法？

A26.兩個辦法：1)適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量; 2)延長加入CCK-8后的反應(yīng)時間。

Q27.在做藥物毒性實驗時，加入CCK-8培養(yǎng)一段時間后，檢測時顏色沒有變化，樣品和空白O.D.值一樣，是何原因？

A27.可能因素有2個：藥物的濃度太高，細(xì)胞全部被殺死；如果藥物有氧化性，則會抑制CCK-8試劑的顯色反應(yīng)，可以采取先更換培養(yǎng)基清洗掉藥物，然后再加CCK-8試劑進行檢測的方法。

Q28.如何避免細(xì)胞聚團現(xiàn)象？

A28. 1) 消化時間長一些。2) 細(xì)胞培養(yǎng)好后，手搖或設(shè)備搖勻。3)用槍頭反復(fù)吹打，但要避免產(chǎn)生氣泡。

Q29.做懸浮細(xì)胞的實驗時，檢測幾天比較合適？

A29.由于不更換培養(yǎng)基長時間的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的氧氣和營養(yǎng)會流失，會影響細(xì)胞的狀態(tài)。建議培養(yǎng)4-5天左右，但要確定細(xì)胞數(shù)量是否已經(jīng)達到飽和？如果需要長時間培養(yǎng)，因為容易蒸發(fā)，建議培養(yǎng)板的邊緣孔不加細(xì)胞。

Q30.如何制作標(biāo)準(zhǔn)曲線？

A30.先取已知細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，然后用培養(yǎng)基一次等比例稀釋成一個系列濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后加CCK-8試劑，培養(yǎng)一段時間，等顏色發(fā)生明顯變化后，用酶標(biāo)儀進行測定，以細(xì)胞數(shù)量為X軸，O.D.值為Y軸，就可以做成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Q31.細(xì)胞數(shù)量太多會有什么結(jié)果？

A31.貼壁細(xì)胞如果接種太多，細(xì)胞在培養(yǎng)過程中容易長滿而產(chǎn)生互相擠壓的現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不好或者死亡。另外細(xì)胞接種太多容易產(chǎn)生O.D.值過高（甚至于超過儀器的檢測范圍）的情況。

Q32.BrdU法和CCK-8法有何區(qū)別？

A32.CCK-8法師通過檢測對數(shù)生長期的細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶來反映細(xì)胞的活性，而BrdU法是檢測細(xì)胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入知己，通過比色法就可以檢測，而BrdU法不僅要加入試劑，而且要固定細(xì)胞，通過抗原抗體反應(yīng)之后用發(fā)光法來檢測。兩者的原理是*不同的。如果只是檢測細(xì)胞增殖的話，那么CCK-8的方法是比較簡單的。

Q33.在做藥物毒性實驗時，藥物對細(xì)胞有抑制作用，但檢測結(jié)果卻是O.D.值升高，為什么？

A33.很可能藥物和CCK-8試劑發(fā)生了反應(yīng)，可以做一個只加藥物的空白對照，如果O.D.值確實比正常的空白對照O.D.值高很多，則說明藥物和CCK-8試劑發(fā)生了反應(yīng)。可以通過更換培養(yǎng)基清洗掉藥物的辦法解決。

Q34.加入CCK-8試劑后，為什么在不同時間檢測的值不一樣（例如在3小時和在3.5小時）？ A34.由于CCK-8試劑和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)是一個循環(huán)反應(yīng)，隨著時間的增加，O.D.值也會不斷增加，顏色會不斷加深，但細(xì)胞數(shù)量卻沒有什么太大變化。一般情況下建議在確定較佳的實驗條件（合適的時間、合適的O.D.值）后，把加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間固定下來，以后在同樣的培養(yǎng)時間點進行檢測。

Q35.組內(nèi)數(shù)據(jù)差異比較大或組間數(shù)據(jù)雜亂，沒有規(guī)律，是何原因？

A35.原因有可能是CCK-8試劑在移液槍的槍頭上或培養(yǎng)板的孔壁上殘留，加入時較好快速加入以避免殘留，可以用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑的辦法來降低誤差：用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑1倍，混勻后每孔加20ul使用。

Q36.用CCK-8試劑做細(xì)胞毒性檢測時：1）貼壁細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)多長時間合適？2）預(yù)培養(yǎng)過程中細(xì)胞分裂，如何計算細(xì)胞數(shù)量？3）如果預(yù)培養(yǎng)時間太長，會有什么結(jié)果？

A36. 一般情況下建議貼壁細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)的時間為24h. 如果只計算藥物的LD50值的話,可不必考慮預(yù)培養(yǎng)過程中的細(xì)胞分裂問題,但要做一個加細(xì)胞的對照(該值為較大值)。 如果預(yù)培養(yǎng)時間太長，有可能細(xì)胞會增長過多，達到飽和狀態(tài)，O.D.值將會很高，甚至?xí)^儀器的檢測范圍。

Q37.在實驗中加入刺激細(xì)胞增長的因子，但是細(xì)胞數(shù)量卻沒有增加（或者吸光值沒有上升），為什么？

A37.首先用顯微鏡觀察一下，確定細(xì)胞數(shù)量是否增加？然后才考慮其他的因素（如果加入的刺激因子和CCK-8發(fā)生反應(yīng)的話，吸光值不變這種可能性是非常低的）。如果顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量確實增加了，則請檢查加入的藥物是否具有氧化性？有可能抑制了CCK-8試劑的反應(yīng)。方法是：在有細(xì)胞的培養(yǎng)基中做1個加藥物和不加藥物的對比，然后分別加入CCK-8試劑進行檢測，如果不加藥物的O.D.值比加藥物的O.D.值高，則說明藥物確實具有氧化性，產(chǎn)生了干擾。

Q38. Cell Counting Kit-8法實驗中每孔應(yīng)該接種多少細(xì)胞？

A.38貼壁細(xì)胞每孔至少需要接種1,000個細(xì)胞 (100 mL的培養(yǎng)基)，檢測白細(xì)胞時由于它的靈敏度較低，每孔至少需要接種2,500個細(xì)胞 (100 mL的培養(yǎng)基)，建議先做幾個孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量。如果要使用24孔板或是6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

Q39.  哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？

A39. 當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK-8的測定，增加OD值，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定 )。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

Q40. 在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

A40有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK-8試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (只加CCK-8) 的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q41. CCK-8對細(xì)胞是否有毒？

CCK-8對細(xì)胞的毒性相當(dāng)?shù)汀?/span> CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細(xì)胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。

Q42.. Cell Counting Kit-8試劑穩(wěn)定嗎？

A42. CCK-8在避光0～5℃的條件下可以存放1年，在-20度下避光可以保存2年。反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。 在常溫下可以保存3周左右，顏色應(yīng)該為淺紅色，如果顏色發(fā)生改變，則可能會增加空白吸光度。

Q43.  我沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他的濾光片？

A43可以使用吸光度在430～490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度較高。

Q44. CCK-8能否對活細(xì)胞進行染色?

A44不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽，并通過電子載體將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的CCK上，因為CCK及其生成的甲瓚染料是高度水溶性的，不會進入細(xì)胞內(nèi)，所以CCK-8不能對活細(xì)胞進行染色。

Q45. 如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可以采取2個辦法：  適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量和 延長加入CCK試劑后的染色時間。