小鼠IgE抗體檢測試劑盒Mouse Total IgE Kit

發布時間：2021/3/9

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小鼠總IgE抗體檢測試劑盒

Mouse Total IgE (IgEa and IgEb) Detection ELISA Kit

Ca#3005

背景簡介：

Ⅰ型超敏反應是一種典型的過敏性疾病，如哮喘、濕疹、花粉熱、蕁麻疹等。這種超敏反應是由IgE抗體介導的。IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，并通過FcεRI（1）的穩定和積累顯著上調FcεRI的表達，增強對過敏原的超敏反應。與細胞表面IgE抗體結合的特異性變應原交聯FcεRI（2-3），引起肥大細胞的刺激和脫顆粒。這與多種促炎介質和細胞因子的釋放有關，如組胺、蛋白水解酶、肝素和趨化因子，這些都會導致與I型超敏反應相關的癥狀。在過敏性疾病和寄生蟲感染的疾病中，血清IgE抗體水平通常會升高。盡快血清IgE水平不能單獨反應患者的過敏狀態和臨床癥狀，但是很明顯血清IgE水平升高有助于診斷人類的這些疾病。

試劑盒組分：

組分	數量	規格	保存溫度
IgE標準品（30051）	1	100ng/瓶，凍干粉	-20℃
捕獲抗體（30052）	1	0.1ml	-20℃
檢測抗體（30053）	1	凍干粉	-20℃
溶液A-包被緩沖液（30054）	1	10ml	-20℃
溶液B-樣本、標準品緩沖液（30055）	1	50ml	-20℃
溶液C-檢測抗體緩沖液（30056）	1	10ml	-20℃
溶液D-鏈親和素-HRP緩沖液（9055）	1	20ml	-20℃
鏈親和素-HRP(9029)	2	50ul/管	-20℃
TMB 顯色液（90023）	2	0.2ml	-20℃
顯色液稀釋液（90022）	1	10ml	-20℃
洗液，20X(9005)	1	50ml	-20℃
ELISA 板	1	96孔（8x12）	-20℃

檢測流程：

1)加入100ul 稀釋后的捕獲抗體到各孔。

2）4℃孵育過夜，洗板。

3）加入100ul稀釋后的標準品和樣本。

4）室溫孵育2小時，洗板。

5）加入100ul稀釋后的檢測抗體。

6）室溫孵育1小時，洗板。

7）加入100ul吸收后的鏈親和素-HRP。

8）室溫孵育1小時，洗板。

9）加入100ul TMB顯色液

10）室溫孵育25min

11)加入50ul終止液

12）讀取450nm/630nm吸光度值

注意事項：

建議樣本、標準品均做復孔檢測
用前所有的緩沖液置于室溫平衡
20X洗滌液低溫可能會有結晶析出。如果有結晶析出，把洗滌液瓶置于溫水中直至結晶*溶解。
用移液器準確定量提供的緩沖液，提供額外的緩沖液。
每個步驟結束后，用封板膜封板，防止蒸發。
如果只是用部分試劑，請參照操作步驟中的用量，做相應的使用量緩沖液配制。未使用的儲液在原包裝管內保存，置于-20℃保存。
正常小鼠總IgE水平大概在50-100ng/ml,氫氧化鋁佐劑免疫2周后，抗體水平提高到ug/ml。隨后用抗原免疫后增加至10-20ug/ml。

操作流程：

1.加入包被抗體：用10ml包被抗體稀釋液（Solution A）稀釋1管包被抗體。或者根據用量按下表稀釋。加入100ul稀釋后的包被抗體液到各孔，4℃過夜孵育。剩余包被抗體儲液-20℃凍存用于后續實驗。

板條數	包被抗體	溶液A(ml)
2	17	1.7
4	33	3.3
6	50	5.0
8	66	6.6
10	82	8.2
12	100	10.0

2.制備標準品稀釋液：推薦的標準品范圍是1.6-100ng/ml。用樣本/標準品稀釋液（Solution）1ml稀釋1管標準品（100ng/管），制備100ng/mlIgE標準品儲液，隨后用稀釋液做系列稀釋，制備：100ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.3ng/ml, 3.1ng/ml, 1.6ng/ml。剩余的標準品儲液（100ng/ml）可以-20℃保存，用于后續實驗。建議您每次實驗室，制備新鮮標準品。

3.制備稀釋樣本：正常血清推薦稀釋比是1:10-1:50。免疫過的小鼠血清稀釋比從：1:100~1:1000，具體取決于免疫程序和血清樣本收集時間。

4.洗滌緩沖液稀釋：用950ml雙蒸水（1x洗液）稀釋50ml 20x洗液。用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

5.加入標準品和樣本：加入100ul標準品，SolutionB(空白)和樣本到對應孔（做復孔。）室溫孵育2小時。

6.洗滌：用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

7.加入檢測抗體：用10ml檢測抗體稀釋液（SolutionC）稀釋1管檢測抗體。或者用50ul SolutionC稀釋1管檢測抗體，按表格里需求量稀釋。加入100ul抗體抗體稀釋液到各孔，室溫孵育1小時.

板條數	檢測抗體（ul）	溶液C(ml)
2	8	1.7
4	17	3.3
6	25	5.0
8	33	6.6
10	42	8.2
12	50	10.0

8.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

9.加入鏈霉親和素-HRP:用10ml鏈霉親和素稀釋液(Solution D)稀釋1管鏈霉親和素-HRP。加入100ul稀釋后的鏈霉親和素稀釋液到各孔，室溫孵育1小時。

板條數	檢測抗體（ul）	溶液C(ml)
2	8	1.7
4	17	3.3
6	25	5.0
8	33	6.6
10	42	8.2
12	50	10.0

10.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

11.加入TMB:用新管制備TMB。用前10ml底物稀釋液一管TMB。加入100ulTMB稀釋液到各孔，室溫孵育25min。

板條數	TMB（ul）	底物稀釋液(ml)
2	34	1.7
4	66	3.3
6	100	5.0
8	132	6.6
10	164	8.2
12	200	10.0

12.終止：加入50ul 2N硫酸（終止液）到各孔。

13.讀板：讀取450nm OD值。如果樣本OD值大于標準品高OD值，樣本稀釋后重新檢測。630nm波長，檢測的副波長。

結果計算：

1.計算空白孔、樣本和標準品OD值的平均值。

2.用標準品和樣本OD均值減去空白孔OD值。

3.用標準OD值和標準品濃度值，繪制標準曲線。用Log/Log擬合曲線。見圖例1.

4.通過回歸曲線計算樣本中濃度值，通過乘稀釋倍數得到樣本的原始濃度值

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