鈣衛蛋白ELISA 檢測試劑盒

生產廠家：德國Immundiagnostik公司

貨號： K6927

1.應用：

該試劑盒用于定量檢測人糞便中的鈣網蛋白含量。

2. 簡介：

鈣衛蛋白是一類主要由單核細胞和中性粒細胞分泌的鈣結合蛋白。糞便鈣衛蛋白是腫瘤及胃腸道疾病的檢測標記物。臨床上常常很難區分腸道易激綜合征和慢性炎癥腸道疾病。這就導致常常需要做大量的非必要的結腸鏡檢查。而鈣衛蛋白可以很清楚的分辨這兩種疾病。糞便鈣衛蛋白與組織學及鏡檢檢測炎癥性腸病及潰瘍性結腸炎以及被視為腸道疾病檢測金標準的indium-111標記嗜中性粒細胞的檢測結果呈顯著相關性。然而，用indium-111標記嗜中性粒細胞檢測腸道疾病費用成本非常高（住院費用，分析檢測及同位素處理），同時患者還需要做放射性檢測。由于這個原因，不推薦用這個方法用于反復檢測小孩或孕婦患者。

鈣衛蛋白是優于其他炎癥類標記物（CRP，ESR HB）用于腸道疾病復發檢測的的一個*的預測標記物。與標準的用大便潛血檢測結腸癌相比，糞便鈣衛蛋白檢測明顯占有優勢。如果糞便中的鈣衛蛋白含量很低，說明腸道疾病發生的概率極小。

3.試劑盒組分：

4. 試劑制備與保存：

• 如果不是單次用完試劑盒，請按試劑瓶標簽上說明保存相應試劑。按照單次的使用量制備相應試劑。
• 體積少于100ul的試劑，在用前請離心。
• 洗滌緩沖液在用前用超純水做10倍稀釋（100ml儲液+900ml超純水），充分混勻。由于是高濃度的儲液，在儲存過程中可能會有結晶出現。如出現結晶請在室溫或37℃待結晶*溶解。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個月。
• 提取緩沖液在用前用超純水1:2.5稀釋（100ml IDK Extract +150ml超純水），充分混勻。如出現結晶請在室溫或37℃待結晶*溶解。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個月。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個月。
• 標準品和對照，需用500ul超純水稀釋。將瓶內容物至于室溫溶解10min，然后輕柔上下顛倒混勻，確保充分溶解。重懸后的標準品和對照可在2-8℃保存4周。
• 其他的時間均為即用型試劑。

5. 樣品制備和保存

大便樣本

糞便中的鈣衛蛋白在室溫可保存3天。盡管這樣，我們推薦糞便在2-8℃保存時間不要超過48h。長期保存，請置于-20℃保存。冰凍的糞便樣本，請在分析前先置于2-8℃，然后在置于室溫解凍。冰凍可導致糞便中的嗜中性粒細胞釋放鈣衛蛋白，因此冰凍樣本相對于新鮮樣本來說，鈣衛蛋白含量稍高。

糞便樣本中的一些添加劑，可能會對鈣衛蛋白的檢測起到干擾作用。因此請使用：空的離心管或試劑盒提取緩沖液加到管內。

糞便提取物

糞便提取在室溫、2-8℃、-20℃均可保持穩定性9天，反復凍融不要超過3次。

糞便樣本的提取：

稀釋的提取緩沖液（Diluted extraction buffer IDK Extract）用作樣本提取的緩沖液。我們推薦用以下方法制備糞便提取物。

Stool Sample Application System(SAS) (Cat.No.:K6998SAS)

糞便樣本管：

請注意樣本的稀釋倍數依據糞便量及緩沖液體積決定。

用1.5ml緩沖液稀釋SAS

請按照SAS說明書制備糞便樣本：

1. 冰凍的糞便樣本，需要先解凍。對于一些特殊的樣本，需要勻漿
2. 提取樣本前，在空離心管內加入1.5ml IDK Extract extraction Buffer.加入后，置于室溫。
3. 打開管蓋。插入量油尺后，中下部的量油尺有一凹槽，需要用糞便*覆蓋。當將stick插入管內后，過多的量將溢出，而剩下15mg需要稀釋的糞便樣本。蓋上管蓋。
4. 搖動離心管，直至在凹槽沒有糞便樣本存在，請確保充分溶解。對于一些固體樣本，樣本用緩沖液浸濕10min，有利于樣本檢測。
5. 讓樣本置于管內10min，確保沉淀充分溶解，漂浮的一些類似谷類的物質，可忽略不計。
6. 輕輕的打開管蓋以及量油尺的綠色的環。丟棄蓋子以及量油尺，確保收集到的沉積物不再分散。

Dilution I :  1:100 稀釋提取物

重懸后的樣本用樣本稀釋緩沖液（SAMPLEBUF）1:25稀釋。例如：

40 ul懸液+960ul樣本稀釋緩沖液=1:25(Dilution I)，zui終稀釋比：1:2500

取100ul樣本用于檢測。

6. 檢測程序：

檢測原理:

試劑盒采用雙抗夾心ELISA檢測原理。標準品、對照和稀釋的檢測樣本與包被的人鈣衛蛋白抗體發生反應。孵育，樣本中的鈣衛蛋白月包被抗體發生結合。酶標的抗體加入后，形成：包被抗體-人鈣衛蛋白-酶標抗體復合物。加入TMB底物顯色，zui后加入終止液終止反應。顯色從藍色到黃色，顏色的深淺反應了樣本中鈣衛蛋白含量的高低。用標準品濃度和OD值做標準曲線，通過標準曲線和樣本的OD值，計算樣本中鈣衛蛋白含量。

檢測程序：（推薦做復孔）

1. 將樣本和試劑置于室溫（15-30℃）平衡。
2. 在操作流程上標記處，標準品、樣本及對照所在孔位置。
3. 根據要做的樣本量，選著適當數目的板條。剩余板條覆蓋后，2-8℃保存。
4. 加入：標準品、樣本、對照各加100ul到對應孔。
5. 覆蓋版，室溫孵育30min
6. 吸出孔內液體，用250ul 洗液，洗滌5次。zui后洗滌結束后，在吸水紙上排干孔內液體。
7. 加入100ul標記抗體到各孔。
8. 覆蓋版，室溫孵育30min
9. 吸出孔內液體，用250ul 洗液，洗滌5次。zui后洗滌結束后，在吸水紙上排干孔內液體。

10)加入100ul SUB（底物） 到各孔。

11) 避光室溫孵育10-20min

12) 加入100ul終止液到各孔，充分混勻

13）讀取450nm吸光度，副波長620nm ( or 690nm)。如果標準品zui高吸光度值超出了儀器檢測值，請立即讀取405nm吸光度，副波長620nm。

   注：顏色變化受溫度影響較大，我們推薦：看到顏色差異后，終止反應。

對于一些ELISA自動化儀器，請依據儀器特點，調整檢測流程。

7. 結果

以下方法用于計算檢測結果。我們推薦4-參數算法。

1）4Parameter algorithm

2）Point to point calculation

3) Spline algorithm

計算結果，依據稀釋倍數，樣本zui終濃度需x2500。

8. 局限

樣本OD超過標準品zui高OD值時，需要 樣本后再測。

9.質控

需要在每次試驗時，都做質控。質控值，用于評價統計方法的可行性。如果質控檢測超過范圍，說明樣本檢測值是無效的。

檢測范圍：

1g 糞便相當于1ml.

• 健康人群的均值為25mg/kg
• 超過50mg/kg的樣本檢測值，認為是陽性的。

推薦各個實驗室依據自身實驗，確定樣本的參考值范圍。

注：許多復雜的因素可導致沒有炎性腸病的情況下，但是糞便中鈣衛蛋白含量卻升高。例如：使用非甾體抗炎藥，一些間歇性的胃腸感染及一些惡性腫瘤都會導致鈣衛蛋白含量卻升高。

在解釋實驗結果及炎性腸病治療效果評價中應考慮這些因素。

兒童糞便鈣衛蛋白檢測范圍：

據文獻：Hestvik E et al. (2011) BMC Pediatrics 11:9 doi:10.1186/1471-2431-11-9

方法：來自于坎帕拉、烏干達，0-12歲的302個健康兒童檢測了糞便鈣衛蛋白

表1.不同年齡段兒童糞便鈣衛蛋白檢測結果

文獻：Fagerberg UL et al. (2003) J Pediatr Gastroenterol Nutr 37:468-472

10 試劑盒參數：

精密度

批內（n=20）

批間（n=12）

特異性：

試劑盒便于溶菌酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、乳鐵蛋白發生反應。

稀釋比：三個不同患者樣本用樣本稀釋緩沖液不同吧比例稀釋后分析后的結果。（n=3）

分析靈敏度：

• 不考慮稀釋比為：2.099ng/ml
• 考慮稀釋比為：5.2475mg/L