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流式細胞儀檢測方法
更新時間：2014-07-01
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一、測定用乙醇固定的DNA的含量
1、培養(yǎng)細胞的DNA含量的測定
制備單細胞懸液于200μl的PBS緩沖液中；
加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃保存；
附:細胞固定的一般步驟
1) 取單細胞懸液1～2×106個細胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；
2) 300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；
3) 重懸細胞于0.5ml PBS緩沖液中；
4) 將細胞懸液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4℃，至少30分鐘。在4℃條件下可保存2~3周。
注意：
² 根據(jù)實驗的要求，固定劑也可選用1～3%多聚甲醛；
² 將乙醇作為固定劑時，乙醇應(yīng)預(yù)冷至0～4℃；
² 細胞在固定時，固定劑應(yīng)緩慢滴入細胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細胞成團（特別是用乙醇固定時）。
² 300g離心5分鐘，去上清，再重懸于400μl PBS中；
² 顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過濾；
² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘；
² 上機檢測。
2、新鮮組織的DNA含量的測定
1) 用200mg濕重組織用機械法制成單細胞懸液；
2) 500g離心5分鐘；
3) 棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；
4) 再過濾，用200目的篩網(wǎng)或70~80μm的篩網(wǎng)過濾；
5) 上機檢測。
3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定
1) 從石蠟包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成單細胞懸液；
2) 用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；
3) 加入PI液1ml室溫避光30分鐘；
4) 調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；
5) 上機檢測。
二、細胞凋亡檢測及相關(guān)分子檢測
1、細胞DNA含量分布（由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡）
² 收集已固定的單細胞懸液約5×105~1×106/ml；
² 離心除去固定液，3ml PBS重懸細胞;
² 1500rpm離心，5分鐘 ，棄去PBS；
² 加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；
² 調(diào)整細胞濃度5×105/ml；
² 上機檢測。
2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡
1) 常規(guī)制備單細胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 血),取約5×106個細胞，1500rpm離心,棄上清,用400μl 1×Binding Buffer重懸；
2) 分成a、b、c、d、e五管，每管約1×106個細胞
a) 陰性對照，不加任何試劑；
b) 陽性對照,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5μl,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190μl 緩沖液、10μl PI避光15分鐘
c) 加10μl PI，避光孵育15分鐘；
d) 加5μl AnnexinV液，室溫避光孵育15min；
e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室溫避光孵育5min；
3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。
4) 上機檢測。
注意 a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；
b. 操作時注意避光；
c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測，在一小時內(nèi)檢測。
3、用單克隆抗體APO2.7檢測細胞凋亡
1) 放置0.5~1×106個細胞到試管中；
2) 室溫離心200g，6min；
3) 棄上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細胞，在冰上孵育20min；
4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室溫離心200g，6min；
5) 棄上清，加入20μl PE標(biāo)記的Apo2.7 單克隆抗體和80μl PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；
6) 加入2ml PBSF液，室溫離心200g，6min；
7) 棄上清，加入1ml PBSF液重懸細胞；
8) 避光保存，直到流式細胞儀檢測。
PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。
三、用流式細胞術(shù)進行DNA周期分析
1、方法：同DNA含量檢測
2、注意：
單細胞濃度應(yīng)約106/ml，以免影響檢測的CV值和檢測結(jié)果；
制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細胞是否聚集或過多碎片），以保證得到足夠的細胞含量；
醛類固定會影響PI與核酸的結(jié)合。
四、免疫熒光標(biāo)記法
1、細胞膜上的免疫熒光檢測法
間接標(biāo)記法
1) 制備單細胞懸液；
2) 細胞計數(shù)，取出1×106個細胞于試管中；
3) 用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù) >90～95%；
4) 在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育30～60分鐘；
5) PBS洗滌1～2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；
6) 加入二抗，孵育20～30分鐘；
7) PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;
8) 加300μl PBS，上機檢測(若不能及時上機檢測，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。
直接標(biāo)記法
①～③同間接標(biāo)記法
④在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育30分鐘；
⑤用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;
⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上機檢測。
2、 細胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法
間接免疫熒光標(biāo)記法
1) 取已制備好的單細胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4℃保存Overnight）；
2) 用PBS洗兩次，棄上清；
3) 細胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室溫10分鐘；
4) 用PBS洗滌兩次；
5) 加入*抗體，室溫30～60分鐘，或4℃Overnight，同時須設(shè)陰性對照或同型對照管；
6) 用PBS洗滌兩次；
7) 加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫20分鐘，避光；
8) 用PBS洗滌1～2次，棄上清；
9) 重懸細胞于500μlPBS中，上機檢測。
直接熒光標(biāo)記法
①～⑤同間接熒光標(biāo)記法；
加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光30分鐘（同時做同型對照管）；
用PBS洗滌１～２次，棄上清；
加300μl PBS上機檢測。
細胞膜上及細胞內(nèi)雙標(biāo)記法（直標(biāo)法）
1) 取出已制備好的未固定的單細胞懸液1×10 6個細胞于試管中；
2) 用PBS洗滌兩次；
3) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來標(biāo)記細胞膜上的抗原，同時加上陰性對照管，室溫孵育20分鐘；
4) 在試管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分鐘；
5) PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清;
6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室溫10分鐘;
7) 用PBS洗滌兩次，棄上清;
8) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫20分鐘孵育;
9) 用PBS洗一遍棄上清；
10) 用300μlPBS重懸細胞，上機檢測
五、流式細胞術(shù)中的幾點注意事項：
1、對照組的設(shè)置：
在流式細胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是值。如需知道值時必須設(shè)置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。
（1）、陰性對照的設(shè)置
² 在實驗過程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實驗，即在實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對照管，作為陰性對照。
² 在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細胞作為陰性對照管，實驗過程及步驟與實驗組務(wù)必相同。（做間接標(biāo)記法時，同樣也可同時設(shè)置“陰性細胞”的陰性對照管作為陰性對照。
² 在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實驗組細胞，取一管，加上與實驗抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。
（2）、陽性對照的設(shè)置：
在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗，應(yīng)設(shè)置陽性對照組，其設(shè)置方法與陰性對照設(shè)置相同。
2、幾點建議：
1) 在實驗過程中，在保證實驗的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量減少實驗工序和過程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實驗過程長，如再加之操作的不熟練，細胞更容易丟失和受損，而造成實驗結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法，以保證實驗的真實性和準(zhǔn)確性。
2) 建議送檢細胞一定要足夠量，一般要求1×106個細胞。不要過少。因為，如細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù)，結(jié)果也不可信。細胞量也不宜過多，因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足，結(jié)果也由此受影響。
3) 同一種細胞需同時做雙標(biāo)記時，須做雙標(biāo)記的同型對照，且兩種抗體所標(biāo)記的熒光顏色務(wù)必不同。
