ELI-SPOT 及其應(yīng)用

更新時(shí)間：2013-06-19

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一、原理

ELI-SPOT，即斑點(diǎn)ELISA，是利用酶標(biāo)板作反應(yīng)容器進(jìn)行的酶聯(lián)免疫反應(yīng)。其基本原理與ELISA相同。首先用捕獲抗體包被反應(yīng)板，封閉后，依次加入待檢標(biāo)本、生物素化檢測(cè)抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)顯色，利用倒置顯微鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于可在與體內(nèi)（活體條件）極接近的條件下，在體外對(duì)細(xì)胞分泌成分（如細(xì)胞因子、Fas等）進(jìn)行追蹤研究。

幾點(diǎn)說明：

l 反應(yīng)板：ELI-SPOT所用的反應(yīng)板可以是PVDF膜包被好的，也可以是普通酶標(biāo)板。如用普通酶標(biāo)板，需用特制的瓊脂糖底物溶液。因此，ELI-SPOT又可分為PVDF法和瓊脂糖法。

l 待檢標(biāo)本須制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)劑刺激后產(chǎn)生相應(yīng)的因子。

l 細(xì)胞誘導(dǎo)方法：細(xì)胞誘導(dǎo)可分為直接法和間接法。如果細(xì)胞誘導(dǎo)過程是在抗體包被的反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行的，即為直接法；如果細(xì)胞誘導(dǎo)過程是在24孔板或燒杯中進(jìn)行的，即為間接法。采用直接法還是間接法取決于以下幾個(gè)方面：?待分析細(xì)胞的類型。‚預(yù)期的能分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)。如果預(yù)期的可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量少，建議使用直接法；如果可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量特別高，用間接法。

l 誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時(shí)間的選擇：與待檢因子種類相關(guān)，參照下表（廠家提供，僅供參考）

待檢因子	樣本來源	誘導(dǎo)劑	誘導(dǎo)時(shí)間	檢測(cè)用細(xì)胞量
Human IL-2	PBMC	PMA, Ionomycin	10-15 hours	5x10⁴-1x10⁵
Human IL-4	CD4+ T細(xì)胞	PMA, Ionomycin	10-15 hours	2x10⁵-2.5x10⁵
Human IL-6	PBMC	LPS	10-15 hours	1x10⁴-2.5x10⁴
Human IL-10	PBMC	LPS	20-24 hours	2x10⁵-2.5x10⁵
Human IL-12	PBMC	LPS	Overnight	1x10⁵-2.5x10⁵
Human IFN-γ	PBMC	PMA, Ionomycin	10-15 hours	2x10⁴-5x10⁴
Human TNF-α	PBMC	LPS	10-15 hours	2x10⁴-4x10⁴
Human Fas L	PBMC	Anti-human CD3 （B-B11）, IL-2, / PMA,Ionomycin	3days,10-15 hours	3x10⁵-4x10⁵
Murine IFN-γ	PBMC	PMA, Ionomycin	10-15 hours	2x10⁴-5x10⁴
Rat IFN-γ	PBMC	PMA, Ionomycin	10-15 hours	2x10⁴-5x10⁴
Rat TNF-α	Rat splenocyte	LPS	10-15 hours	2x10⁴-4x10⁴

二、 ELI-SPOT 操作步驟

A：PVDF法

1． 96孔PVDF包被板經(jīng)70%已醇處理后，用捕獲抗體進(jìn)行包被。

2．單細(xì)胞懸液（含適當(dāng)誘導(dǎo)劑）加入反應(yīng)孔內(nèi)，孵育（直接法）；如用間接法，細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后，取適量誘導(dǎo)過的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。

3．倒掉細(xì)胞，加入生物素化檢測(cè)抗體，孵育。

4．加鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。

5．加入BCIP/NBT底物，形成斑點(diǎn)。

B：瓊脂糖法

1．用捕獲抗體包被酶標(biāo)板。

2．單細(xì)胞懸液（含適當(dāng)誘導(dǎo)劑）加入反應(yīng)孔內(nèi)，孵育（直接法）。如用間接法，細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后，取適量誘導(dǎo)過的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。

3．倒掉細(xì)胞，加入生物素化檢測(cè)抗體，孵育。

4．鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。

5．加入瓊脂糖底物溶液，形成斑點(diǎn)。

三、 ELI-SPOT 檢測(cè)單細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的意義

細(xì)胞因子是一類由白細(xì)胞和其它一些細(xì)胞產(chǎn)生的，可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞。大多數(shù)細(xì)胞因子是生長(zhǎng)或分化調(diào)節(jié)因子，通常在造血系統(tǒng)中發(fā)揮作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在腦、肌肉和內(nèi)分泌器官間也存在相互作用，另外，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些疾病中，如急性炎癥、血液病、癌癥和自身免疫性疾病中可常見細(xì)胞因子的異常表達(dá)。

在單細(xì)胞水平進(jìn)行細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)提供了zui接近“原位”環(huán)境的，即zui接近體內(nèi)條件，觀察細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體外進(jìn)行與體內(nèi)環(huán)境相似的研究。利用這一方法，可跟蹤細(xì)胞因子的產(chǎn)生、跟蹤疾病進(jìn)展、調(diào)整臨床治療策略、防止病情惡化以及致命后果的發(fā)生。

四、 ELI-SPOT應(yīng)用

1．在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中，給大鼠注射干擾素β后，可顯著隆低可產(chǎn)生干擾素γ的細(xì)胞的數(shù)量。（1）

2．進(jìn)行免疫基因肽疫苗的評(píng)價(jià)。（2）

3．接種途徑效果的評(píng)估。（3）

4．研究TH1/TH2 T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方式以及由一個(gè)亞群向另一個(gè)亞群轉(zhuǎn)換的情況。（4，5）

5．成功檢測(cè)黑色素瘤中腫瘤活性T細(xì)胞數(shù)量。（6）

6．用于重癥肌無力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細(xì)胞的研究。（7）

五、參考文獻(xiàn)：

1． Ruuls, S.R. et al., 1996 J. Immunol. 157:5721

2． Kulane, A. et al., 1997 Acta Tropica. 68:37

3． Ibsen, M. W. et al., 1997 Scand. J. Immunol. 46:274

4． Gabrielsson, S. et al., 1997 Allergy. 52:860

5． Elaghazali, G. et al., 1997 Clin. Exp. Immunol. 109:84

6． Scheibenbogen, C. et al. 1997 Int. J. Cancer 71:932

7．侯世芳，閆曉波，王維治，1999 第六屆全國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編