國外醫(yī)學(xué)計(jì)劃生育分冊2000年2月第19卷第1期

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（400046）

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　　　摘要 　胚胎著床過程的調(diào)節(jié)十分復(fù)雜，近年來細(xì)胞生長因子參與胚胎發(fā)育和著床的功能研究十分熱門，在細(xì)胞生長因子發(fā)揮作用的網(wǎng)絡(luò)中，表皮生長因子起著舉足輕重的作用，是著床過程順利完成*的因子之一。本文就表皮生長因子改善胚胎發(fā)育、啟動(dòng)胚胎著床、調(diào)節(jié)植入過程等內(nèi)容進(jìn)行簡要綜述。

　　關(guān)鍵詞：表皮生長因子 胚胎 發(fā)育 著床

　　自1962年Cohen從雄鼠頜下腺分離提純出表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）以來，已證明EGF對多種組織來源的細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用。除頜下腺以外，人體的多種組織也EGF分布，如：十二指腸的Brnners腺、含中性粘蛋白的胃粘膜細(xì)胞系、外分泌腺體以及多種腫瘤細(xì)胞等。EGF還常見于包括精液、羊水在內(nèi)的正常體液中。已經(jīng)證實(shí)，在子宮內(nèi)膜、蛻膜、著床前胚胎、滋養(yǎng)層細(xì)胞等生殖組織中存在EGF和/或EGF受體（EGF-R），EGF通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌途徑，單獨(dú)或通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine net），參與內(nèi)膜準(zhǔn)備、胚胎發(fā)育、植入過程、妊娠維持、胎盤激素合成分泌等生理過程的調(diào)節(jié)^[1～3]。

　　一、表皮生長因子及其受體

　　小鼠EGF是一種含53個(gè)氨基酸的單鏈多肽，編碼小鼠EGF的信使核糖核酸（mRNA）含4 800對堿基，翻譯出的EGF前體有1217個(gè)氨基酸殘基，含數(shù)個(gè)糖基位點(diǎn)，與低密度脂蛋白（LDL）序列相似，因而EGF前體可能是一種有受體功能的膜糖蛋白。成熟的EGF分子內(nèi)含3個(gè)二硫鍵，活性中心位于48～53個(gè)氨基酸殘基之間，分子量為6.045kd，等電點(diǎn)4.6，耐熱及耐胰蛋白酶、糜蛋白酶。不同種類的EGF雖然氨基酸數(shù)量和排列有差別，但存在一定的交叉反應(yīng)。，人EGF從尿液中提取出來時(shí)，稱作尿抑胃素（urogastrine），其生物學(xué)活性及氨基酸序列與小鼠EGF相似。

　　EGF-R是一種糖蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞，是一條被質(zhì)膜分為內(nèi)、外兩個(gè)區(qū)段的單一多肽鏈。EGF-R含1186個(gè)氨基酸殘基，分子量170kd，富含甘露糖。人的EGF-R基因位于第7號染色體短臂上。除細(xì)胞膜外，核內(nèi)也EGF-R分布，二者具有相同的抗原性。EGF-R的結(jié)構(gòu)和功能在不同種屬動(dòng)物中基本相似，分子進(jìn)化較保守。EGF-R本身具有蛋白激酶的活性，與配體的結(jié)合具有特異性、高親和性等特點(diǎn)^[1]。EGF-R在胎盤的分布比在子宮內(nèi)膜、蛻膜等處要高1000倍，而且主要分布于合體滋養(yǎng)層^[4]。

　　EGF家族的成員為數(shù)不少，由于它們的受體相同，因此或多或少地參與了胚胎的發(fā)育和著床的過程，研究較為廣泛而深入的是EGF，其次是轉(zhuǎn)化生長因子（TFG）和肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF），Amphiregulin、Cripto、Betacellulin、 neu以及Epiregulin與著床的調(diào)節(jié)只有少量報(bào)道^[5]。

　　二、EGF與早期胚胎發(fā)展

　　著床的先決條件是胚胎的正常發(fā)育和脫透明帶。Morita^[6]用EGF處理體外培養(yǎng)的胚泡，然后移植入同步發(fā)情、處于假孕第4d受體母鼠的子宮內(nèi)，結(jié)果著床率為77.9%，與在體內(nèi)胚泡的發(fā)育接近，為84.2%，而體外培養(yǎng)未加EGF有胚泡，移植后的著床率只有57.1%。其原因可能是EGF顯著刺激小鼠胚泡滋養(yǎng)層細(xì)胞的外延生長，增加與子宮內(nèi)膜的粘附。Taga^[7]1992年的實(shí)驗(yàn)顯示，EGF對小鼠2細(xì)胞的發(fā)育不表現(xiàn)出明顯的效應(yīng)，只在桑椹胚以后，EGF自分泌和旁分泌才對胚胎的發(fā)育起作用。然而Buyalos^[8]發(fā)現(xiàn)，將小鼠2細(xì)胞胚胎培養(yǎng)在EGF含量為2～100mg的培養(yǎng)液中，72h后，*擴(kuò)展和正在孵化的胚泡的比例明顯高于對照組，且EGF的促進(jìn)作用可被抗EGF抗體所阻斷。Terual^[9]將小鼠2細(xì)胞胚胎單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，EGF可明顯增加胚胎的分化生長速率，證明EGF對小鼠2細(xì)胞胚胎的生長有促進(jìn)作用。EGF是否作用于早期胚胎取決于胚胎EGF-R的有無及活性，免疫熒光測定出小鼠未受精卵細(xì)胞和2細(xì)胞胚胎中呈現(xiàn)很弱的EGF-R熒光，4細(xì)胞以后各期，熒光逐漸增強(qiáng)。除滋養(yǎng)層細(xì)胞外，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中也EGF-R的表達(dá)，RT-PCR測出4細(xì)胞后EGF-R mRNA顯著長高，說明從8細(xì)胞開始合成的受體蛋白源自胚胎的mRNA，而受精卵和2細(xì)胞胚胎內(nèi)的mRNA則可能是母源性的^[10]。

　　Merriman^[11]將未受精的小鼠卵細(xì)胞在EGF的培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟處理，受精后分裂至2細(xì)胞階段的能力高于對照組，將這些2細(xì)胞胚胎移植人受體假孕小鼠后，著床率為64%～78%，略低于正常著床率89%。Grupen^[12]用EGF處理豬的卵細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能提高進(jìn)行減數(shù)分裂的成熟卵細(xì)胞的比例，源于這些卵細(xì)胞受精后囊胚的形成率比對照組高，此結(jié)果表明，EGF對豬卵細(xì)胞的減數(shù)分裂和細(xì)胞質(zhì)成熟具有重要作用。

　　EGF不僅對小鼠，而且在多種哺乳動(dòng)物中都表現(xiàn)出對著床前胚胎發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。Johnson^[13]證實(shí)在大鼠妊娠4、5、6d的子宮腺上皮中存在EGF、TGF-α和EGF-R，EGF-R同時(shí)還存在于正在植入的胚胎和子宮基質(zhì)的蛻膜細(xì)胞上。Gharib^[4]在綿羊圍著床期滋養(yǎng)層細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)EGF-R存在，其分子量與小鼠EGF-R相同，為170kd，EGF和EGF-R的存在提示EGF參與了調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育。Zhang^[15]從著床前的豬胚胎上同樣發(fā)現(xiàn)分子量為170kd的EGF-R，該受體蛋白在有EGF和ATP時(shí)發(fā)生磷酸化。此外，在兔^[16]、牛^[17，18]、貓^[19]、馬^[20]等動(dòng)物的滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上都證實(shí)有EGF和EGF-R，EGF能夠刺激體外培養(yǎng)胚胎的卵裂，使之更快發(fā)育至囊胚期。停滯發(fā)育（arrested development）是斑點(diǎn)鼬（一種小型食肉目哺乳動(dòng)物）生殖生理的奇特表現(xiàn)，即胚胎著床前要經(jīng)歷180～220d的“休眠”，Paria^[21]運(yùn)用放射自顯影技術(shù)顯示，在斑點(diǎn)鼬子宮腺上皮、內(nèi)膜基質(zhì)、肌層和血管上存在EGF結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)步用Northern雜交表明，延緩著床和圍著床期間子宮和胚泡上均有類似于小鼠的EGF-R，分子量也為170kd的受體蛋白。用EGF分子誘導(dǎo)，僅在胚胎“蘇醒”恢復(fù)發(fā)育時(shí)，EGF誘導(dǎo)的蛋白酪氨酸激酶（PTK）的活性才顯著升高，在停滯發(fā)育時(shí)期，PTK活性無變化。這些結(jié)果表明，EGF在斑點(diǎn)鼬的胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)中起著重要作用，特別是EGF-R的數(shù)量或功能狀態(tài)可能是胚胎被激活以及著床的先決條件。

　　三、EGF與著床啟動(dòng)

　　在正常生理過程中，雌激素的第二次峰值對于胚胎著床的開始是必需的。Johnson通過切除大鼠垂體，同時(shí)給與孕酮支持建立胚胎延緩著床模型^[13]，在這個(gè)模型中，由于缺乏雌激素，胚胎無法著床，但當(dāng)給這些大鼠靜脈注射100mgEGF，同時(shí)移植人延緩著床胚胎時(shí)，約有73%的大鼠子宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)了著床點(diǎn)，EGF雖然能夠啟動(dòng)著床，但在體內(nèi)是否參與雌激素的誘導(dǎo)著床作用以及作用方式如何尚不明確。Johnson^[22]在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果在注射EGF1h前先給與消炎痛（indomethacin，一種前列腺素合成酶的抑制劑），EGF啟動(dòng)著床的作用可被阻斷，但對雌二醇的作用則無影響，這個(gè)結(jié)果一方面說明EGF、雌二醇啟動(dòng)著床的途徑可能不同；另一方面提示前列腺素參與調(diào)節(jié)著床過程。Tamada^[23]測定了EGF對大鼠胚泡著床和蛻膜反應(yīng)的影響作用。結(jié)果表明，在延緩著床大鼠的子宮腔內(nèi)注射EGF，所誘導(dǎo)的著床效果與EGF呈劑量依賴關(guān)系，假孕5d的大鼠接受EGF宮腔注射后，蛻膜反應(yīng)增強(qiáng)，提示EGF在胚胎著床和蛻膜化過程中可能發(fā)揮重要作用。EGF和雌二醇不同的啟動(dòng)著床途徑在Chatterjee^[24]的實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證，作者在用提純的雌激素拮抗劑ICI-182780阻斷雌二醇啟動(dòng)著床的效應(yīng)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)該拮抗劑并不影響EGF。

　　四、EGF與胚胎植入

　　1992年Hofmann^[25]應(yīng)用免疫組化方法證實(shí)人胚植人部位EGF和EGF-R，而且報(bào)道中間型滋養(yǎng)層（intermediaet rtophoblast,IT）也EGF和EGF-R分布，從而為EGF在人體早期妊娠胚胎植入過程具有調(diào)節(jié)作用提供了依據(jù)。EGF、EGF-R在滋養(yǎng)層的免疫活性表現(xiàn)呈下列規(guī)律：合體滋養(yǎng)層＞中間型滋養(yǎng)層＞細(xì)胞滋養(yǎng)層，分布差異的原因尚不明了。

　　有胚胎粘附、侵蝕、穿透子宮內(nèi)膜過程中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡涉及一系列蛋白酶的作用，如：細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（CTB）分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），它能消化內(nèi)膜的細(xì)胞外基質(zhì)；與之對抗的是蛻膜產(chǎn)生其抑制劑TIMPs；子宮內(nèi)膜入滋養(yǎng)層還分泌一種調(diào)節(jié)酶劑，即纖溶酶原激活因子（PA，主要是尿激酶型uPA）。Harvey^[26]在小鼠著床前和著床期子宮內(nèi)膜中都測出TIMPs（1，2，3）和uPA受體有轉(zhuǎn)錄，但只在處于植入侵蝕階段的胚胎中才*次測出MMP-9和uPA的mRNA，原位雜交顯示MMP-9于7.5d時(shí)植入胚胎周圍的滋養(yǎng)層細(xì)胞高表達(dá)，而TIMPs則于緊鄰植入胚胎周圍的蛻膜中高表達(dá)，TGF-β₁刺激TIMPs的產(chǎn)生。uPA主要表達(dá)于外胎盤錐，這樣的表達(dá)方式保證胚胎地植入。Harvey的實(shí)驗(yàn)證明，EGF對這些酶的活性具有調(diào)節(jié)作用。他將妊娠4d的小鼠胚胎培養(yǎng)在含EGF的培養(yǎng)液中，2d后，其MMP-9和uPA的活性增強(qiáng)；白血病抑制因子（LIF）具有同樣效應(yīng)，但從第3d起，EGF失去刺激效應(yīng)，LIF甚至抑制MMP-9和uPA的生成，此結(jié)果說明EGF與LIF一起參與了植入過程中蛋白激酶表達(dá)正確程序的建立。Miyauchi^[27]進(jìn)一步證實(shí)，EGF對uPA釋放的刺激作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)EGF刺激人體內(nèi)膜細(xì)胞釋放組織型PA（tPA）以及PA的抑制劑PAI-1，EGF對tPA和PAI-1釋放的刺激作用在有孕酮存在時(shí)得以增強(qiáng)，推導(dǎo)EGF同孕酮一樣參與著床，部分地通過調(diào)節(jié)纖溶酶原激活因子/纖溶酶系統(tǒng)來完成內(nèi)膜組織凋亡、重建和細(xì)胞遷移。EGF啟動(dòng)著床的作用被消炎痛阻斷這一現(xiàn)象提示，前列腺素可能是其發(fā)揮作用的環(huán)節(jié)之一，而前列腺素本身又是調(diào)節(jié)著床的重要因素之一，它可直接增加蛻膜細(xì)胞中uPA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)^[28]，同時(shí)刺激著床部位內(nèi)膜毛細(xì)血管通透性增加，多種營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入該部位，使得內(nèi)膜疏松水腫而有利于著床。至于EGF與前列腺素相互作用關(guān)系還有待探明。zui近發(fā)現(xiàn)^[29]，通過蛋白激酶C途徑磷酸化cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein,CREB）,EGF能促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞中人絨毛膜促性腺激素-α（hCG-α）基因的轉(zhuǎn)錄，而hCG對胚胎著床具有十分重要的意義。

　　胚泡粘附、植入時(shí)，同類因子中zui早發(fā)揮直接作用的可能是HB-EGF^[30]。表達(dá)于內(nèi)膜上皮的HB-EGF可與細(xì)胞表面的兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合：一是胚泡或滋養(yǎng)層細(xì)胞的EGF-R；二是滋養(yǎng)層細(xì)胞的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）。小鼠胚泡粘附一般發(fā)生在妊娠第4d晚上10點(diǎn)～11點(diǎn)，此前6～7h，HB-EGF開始表達(dá)。體外研究顯示，HB-EGF可使胚泡的EGF-R去磷酸化，從而促進(jìn)胚泡生長、透明帶孵化以及滋養(yǎng)層的擴(kuò)展生長。

　　五、EGF的調(diào)節(jié)

　　EGF是細(xì)胞生長因子網(wǎng)絡(luò)中眾多成員的一員，其功能既受因子之間、各種激素等活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)，又有其自身的旁分泌和自分泌調(diào)節(jié)，機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未*明了。比較統(tǒng)一的觀點(diǎn)是，EGF主要受到雌激素的調(diào)控。Kleinstein^[31]用放射性配體結(jié)合法在兔和人的研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠促進(jìn)植入前子宮內(nèi)膜表達(dá)EGF-R，雌激素拮抗劑可以阻斷這種誘導(dǎo)效應(yīng)，而孕酮并不影響標(biāo)記EGF結(jié)合到內(nèi)膜表面。不僅如此，小鼠胚泡中EGF-R基因的表達(dá)與母體雌激素狀態(tài)密切相關(guān)，Paria^[32]在小鼠妊娠第4d時(shí)切除其卵巢，以后每天（5～7d）注射孕酮，從而建立起延緩著床模型，第7d時(shí)，注射雌二醇，結(jié)果激活胚泡并發(fā)生著床。原位雜交技術(shù)可從正常妊娠D₄胚泡中測出EGF-R的mRNA，但在休眠胚泡中檢測不出。休眠胚泡在注射雌二醇8h后被激活，用半定量RT-PCR法測定，EGF-R的mRNA拷貝數(shù)增加了8倍。以上實(shí)驗(yàn)表明，雌激素對EGF和EGF-R的表達(dá)具有重要的調(diào)節(jié)作用。至于雌激素拮抗劑ICI-182780不影響EGF啟動(dòng)著床的原因，分析是雌激素與EGF發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎著床的作用層次和/或途徑不一所致，雌激素可能通過多種途徑參與調(diào)節(jié)胚胎著床，而EGF可能是這些途徑中比較重要的一環(huán)。

　　EGF主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜，而EGF-R在內(nèi)膜和胚泡（包括滋養(yǎng)層細(xì)胞）均有表達(dá)，但是在小鼠，EGF-R主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜的基質(zhì)和肌層，在內(nèi)膜上皮中，RT-PCR法未測到完整的mRNA分子，只測出轉(zhuǎn)錄分子的片段，這些片段不能翻譯出有功能的EGF-R，而在著床前的囊胚中，完整的EGF-RmRNA十分豐富，由此提示，在胚胎——子宮內(nèi)膜相互作用中，包括EGF、HB-EGF、TGF-α等EGF家庭成員的作用對象是胚泡，而不是子宮內(nèi)膜上皮。

　　六、其它

　　Amphiregulin（Ar）、Cripto等生長因子與著床關(guān)系的研究始于近幾年，報(bào)道的文獻(xiàn)十分有限。Johnson^[34]從未受精的小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎未測出Ar的存在。Tsark^[35]用多克隆抗Ar抗體和間接免疫熒光技術(shù)從桑椹胚和囊胚中測到Ar，Ar分布于胚胎細(xì)胞的胞質(zhì)和核內(nèi)，具有使胚胎加快進(jìn)入囊胚階段，同時(shí)增加胚胎的細(xì)胞數(shù)目的功能，TGF-α也可提高囊胚的形成，但不影響細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果提示Ar以自分泌方式作用于小鼠著床前胚胎，其刺激細(xì)胞增殖、促進(jìn)囊胚盡早形成的能力大于TGF-α。同樣，Cripto的轉(zhuǎn)錄只在囊胚期才見到^[35]，主要定位表達(dá)于胚胎的外胚層和隨后快速生長的外胎盤錐。Xu^[36]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Cripto從囊胚期開始，逐漸表達(dá)于原條和心臟發(fā)生的部位，它對具有收縮性的心肌細(xì)胞分裂和分化的效應(yīng)。Reese^[5]證實(shí)，NDF表達(dá)于植入胚胎周圍的子宮內(nèi)膜中，在延緩著床的小鼠模型中，NDF不表達(dá)，而當(dāng)注射雌激素、激活胚胎著床時(shí)，NDF很快恢復(fù)表達(dá)功能，此結(jié)果提示，NDF可能參與胚胎與內(nèi)膜復(fù)雜的信號傳遞途徑，對胚胎的激活是必要的。

　　七、結(jié)束語

　　EGF雖然在著床過程中表現(xiàn)出多種形式的功能，但就調(diào)節(jié)著床的因素而言，EGF的功能并不如雌激素、孕激素，甚至LIF、IL-1等因子更重要，研究EGF與著床的關(guān)系只是闡明胚胎著床機(jī)制中很小的組成部分，至于EGF在體內(nèi)調(diào)節(jié)著床的完整功能尚有待人們?nèi)パ芯刻接憽?/div>